ガイドワイヤーを使用した生体内ブタモデルの実現可能性

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7185 (2023) この記事を引用

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良性胆道狭窄症（BBS）のいくつかの in vivo ブタモデルが、新しい内視鏡技術および装置の前臨床研究のために最近報告されています。 この研究の目的は、ガイド ワイヤーを利用した管内高周波アブレーション (RFA) を使用して、BBS の大動物モデルの有効性と実現可能性を評価することでした。 総胆管 (CBD) 内で 10 W、80 °C、90 秒で焼灼するための管内 RFA を使用して、6 つの in vivo ブタ モデルを作成しました。 胆管造影法を用いて内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ERCP）が実施され、総胆管の組織学的評価が行われました。 血液検査は、追跡調査の前後、および最終追跡時に検査されました。 ガイドワイヤー支援 RFA 電極は、重篤な合併症を起こすことなく、すべて (6/6、100%) の動物モデルで BBS を生成しました。 すべてのモデルの管内 RFA 後 2 週間の蛍光透視所見により、総胆管内の BBS が明らかになりました。 組織学的評価では、線維化と慢性炎症性変化が認められました。 術後、ALP、GGT、CRPは上昇し、適切なドレイン後に低下しました。 BBS のブタ モデルは、ガイド ワイヤーを利用した管内 RFA を使用して管内熱傷害を誘発することによって開発されます。 ブタに BBS を誘導するためのこの新しい技術は効果的であり、実現可能です。

内視鏡的胆道ドレナージは、良性胆道狭窄（BBS）の初期治療として使用されています。 最近、複数のプラスチック ステントと被覆された自己拡張可能な金属ステントが BBS の管理に有望な結果を示すことが報告されています 1,2。 しかし、胆管ステントを長期間使用して適切な胆管ドレナージを行うことは依然として困難です。 胆管ステントを含む多くの胆管内視鏡装置は、装置の開存性を改善するために最近開発されました 3、4、5。 しかしながら、プラスチックステントの形状や材質を変更することで長期的なドレナージ効果を高めようとする試みは、十分な効果をもたらしていない。 したがって、BBS で内視鏡管理を行う際の制限を改善できる新しいデバイスに対する要求が高まっています。

内視鏡装置をヒトに適用する前に、内視鏡装置の有効性を評価する前臨床研究のために適切な動物モデルが重要です。 これまでの研究では主に外科的に作成された経皮的アプローチが報告されていました6、7、8。 しかし、外科的に作成された経皮的アプローチを使用して動物モデルを作成する手順は手間がかかりました。 最近、いくつかの研究で、内視鏡的胆管アプローチを使用した BBS の in vivo および in vitro 動物モデルの開発が報告されています 9,10,11。 Rumellaらによる最初の内視鏡的胆管アプローチ。 ヒートプローブと多極プローブを使用してBBS12を作成しました。 ただし、これらの研究は、BBS に対する管内高周波アブレーション (RFA) 以外の熱プローブや多極プローブを含む方法を使用して実施されました。 内視鏡を用いた場合でも、内視鏡着脱式スネアなどの非熱傷法を用いて実験を行った。 一部の研究では、臨床現場で一般的に行われる追跡肝機能検査を実施せずに、観察時間が短いと報告されています。

BBS の動物モデルに対する他の熱損傷法と比較すると、管内 RFA デバイスの使用は快適であり、エネルギー線量 (W)、温度 (℃)、および曝露時間 (秒) を制御するのが簡単です。 ガイドワイヤー法を使用すると、胆管内 RFA デバイスは胆管損傷の位置と程度をより簡単に制御できる可能性があります。 しかし、RFA の管内適用に関する研究はわずかしかありませんでした。 さらに、RFA による管内熱傷害に対する効果的かつ安全なエネルギー線量はまだ確立されていません。 したがって、この研究の目的は、胆道内RFAを使用してBBSの再現可能な大型動物モデルの開発を評価し、BBSの製造に適用するための効果的で安全なエネルギーの選択肢を調査することです。

6 つのブタ動物モデルすべてにおいて、出血や穿孔などの合併症を起こすことなく管内 RFA を用いて BSS を生成することに成功しました (成功率 = 100% (6/6)、重篤な合併症率 = 0%)。 すべての実験動物の血中 WBC、AST、ALT、ALP、GGT、および CRP レベルを、管内 RFA 手順の前、管内 RFA 手順後 (RFA の 2 週間後)、および動物を安楽死させる前に測定しました (図 1、2、 3A～G）。 WBC、AST、ALT、ALP、GGT、および CRP の血中レベルは、管内 RFA 処置後に上昇しましたが、胆管ステント留置後は低下しました。 図１Ｈ、Ｉは、実験動物１および２におけるＲＦＡ後２週間の胆管Ｘ線透視所見であり、胆管狭窄を示している。 図 1 と同じ血液検査結果の傾向が図 2 でも観察されました。 図 1 と 2 の違いは、図 2 の胆道ステント留置後 3 か月後に追跡調査が行われたことです。実験動物 3 と実験動物 4 では、RFA 後 2 週間の蛍光透視所見により胆管狭窄が確認されました (図 2H、I)。 実験動物 5 および 6 は胆管ステント留置後 5 か月間追跡調査されました。 血液検査結果も同様の傾向を示しました（図 3A ～ G）。 胆道狭窄は、実験動物５および６におけるＲＦＡ後２週間の蛍光透視所見によっても確認された（図３Ｈ、Ｉ）。

RFA前、RFA後、および1か月の追跡調査時の胆道狭窄の血液検査および胆道造影。 (A) WBC の変化。 (B) T. ビリルビンの変化。 (C) AST の変更。 (D) ALT の変更。 (E) ALP の変化。 (F) GGT の変更。 (G) 1 ヶ月間の追跡調査豚の CRP 変化。 (H) 1 か月の追跡調査時の胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 1)。 (I) 1 か月の追跡調査時の胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 2)。 WBC白血球数、T.ビリルビン総ビリルビン、ASTアスパラギン酸トランスアミナーゼ、ALTアラニントランスアミナーゼ、ALPアルカリホスファターゼ、GGTガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ、CRP C反応性タンパク質。

RFA前、RFA後、および3か月の追跡調査時の胆道狭窄の血液検査および胆管造影。 (A) WBC の変化。 (B) T. ビリルビンの変化。 (C) AST の変更。 (D) ALT の変更。 (E) ALP の変化。 (F) GGT の変更。 (G) 3 か月の追跡調査豚の CRP 変化。 (H) 3 か月間追跡調査した胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 3)。 (I) 3 か月間追跡調査した胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 4)。 WBC白血球数、T.ビリルビン総ビリルビン、ASTアスパラギン酸トランスアミナーゼ、ALTアラニントランスアミナーゼ、ALPアルカリホスファターゼ、GGTガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ、CRP C反応性タンパク質。

RFA前、RFA後、および5か月の追跡調査時の胆道狭窄の血液検査および胆道造影。 (A) WBC の変化。 (B) T. ビリルビンの変化。 (C) AST の変更。 (D) ALT の変更。 (E) ALP の変化。 (F) GGT の変更。 (G) 5 か月後の追跡調査豚の CRP 変化。 (H) 5 か月間追跡調査した胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 5)。 (I) 5 か月間追跡調査した胆道狭窄の胆管造影 (ブタ 6)。 WBC白血球数、T.ビリルビン総ビリルビン、ASTアスパラギン酸トランスアミナーゼ、ALTアラニントランスアミナーゼ、ALPアルカリホスファターゼ、GGTガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ、CRP C反応性タンパク質。

肉眼所見では総胆管（CBD）径は2.5±0.5mmであった。 実験動物採取後に測定した胆管狭窄長は肉眼所見で36mm±0.5mmであった。 H&E染色した組織切片を用いて、炎症の深さ、好中球の沈着の程度、粘膜潰瘍の有無、総合スコアを調べることで組織学的損傷の程度を比較しました（図4、5、表1、2）。 。 プラスチック ステントの組織学的損傷を示す組織学的合計スコアは、1 か月時点の合計スコアよりも 3 か月時点の方が高いことが観察されました。1 か月時点のブタと 3 か月時点のブタの中央値 (範囲): 6 ( 6-8) 対 6.5 (6-8) でしたが、それらの差は統計的に有意ではありませんでした (p = 0.057) (図 4 および表 1)。 しかし、プラスチックステントを5か月間装着した動物グループでは、合計スコアがそれより短い期間装着した動物グループよりも有意に高いことが観察されました（合計スコア、3か月のブタと5か月のブタの中央値（範囲））豚: 6.5 (6-8) vs. 9 (9-9)、p = 0.029) (図 5 および表 2)。 組織損傷の程度を免疫蛍光染色を使用して比較しました（図6）。 上から下に、H&E、マッソントリクローム染色、CK 19 を使用した免疫蛍光染色の顕微鏡写真を示します。 H&E 染色により、プラスチック ステントの接触領域における組織の好中球の沈着の程度が明らかになりました (図 6)。 マッソントリクローム染色後に同じ領域を観察すると、接触領域の組織の広範な線維化が観察されました。 図６の下部では、組織学的評価のためにＣＫ１９を使用して免疫蛍光染色を行った。

組織学的スコアリングシステムを使用した、1か月（左）と3か月（右）の追跡動物モデル間の胆管炎症の顕微鏡画像の比較。

組織学的スコアリング システムを使用した、3 か月 (左) と 5 か月 (右) の追跡動物モデル間の胆管炎症の顕微鏡画像の比較。

ブタ動物モデルのプラスチック製ステント留置胆管の顕微鏡画像。 H-E、MT 染色、CK 19 免疫組織化学 (上から)。 H-E ヘマトキシリン エオシン、MT マッソン トリクローム、CK 19 サイトケラチン 19。

この研究の目的は、ガイド ワイヤー支援管内 RFA を使用して BBS の in vivo ブタ モデルを開発することでした。 生体内胆管を使用した動物実験は、膵胆管プラスチックステント技術の開発および改良プロセスにおける前臨床試験で重要です。 文献によると、ERCP または腹腔鏡手術は、十二指腸乳頭に到達し、取り外し可能なスネアを使用して胆道狭窄モデルを形成するために実行できます11。 胆道狭窄モデルを形成するには、開腹術による管内熱プローブまたは管内高周波温熱療法電極を使用できます10。 この研究では、胆管炎やERCP後膵炎などの術後合併症を引き起こすことなく、ERCPを通じて胆道に高周波温熱療法電極を使用して胆道狭窄モデルを作成することに成功しました。 今後の前臨床研究に大いに役立つことが期待されます。

この研究では、客観的な病理組織学的評価を達成するために、H&E 染色、マッソントリクローム染色、および免疫蛍光染色 (CK 19) を実行しました。 さらに、動物実験室の獣医師病理学者は、以前の研究で一般的に使用されていた補足表 1 に示す組織学的スコアリングシステムに基づいて組織学的スコアを評価および計算しました 13、14、15。 プラスチックステントによって引き起こされる組織学的損傷は、追跡調査時間が長いほど高くなることが判明しました。 興味深いことに、総組織学的スコアは、胆管プラスチックステント挿入後 3 か月未満では、異なる時点間で有意な差を示さなかった。 しかし、ステント挿入後 5 か月の時点で、より短期間の追跡調査の場合と比較して、組織学的スコアに統計的に有意な差が観察されました。 動物実験の結果と費用対効果を考慮すると、RFA 後 1 か月の時点が、BBS の生体内ブタ モデルで新しいデバイスをテストする最適なタイミングであると思われます。 したがって、臨床現場では、組織学的損傷を避けるために、これまでの研究における平均開存期間である 3 ～ 6 か月の間にプラスチック ステントを除去することが推奨されています 16、17、18。

私たちの研究にはいくつかの限界があります。 まず、これは動物実験を使用した前臨床研究でした。 この実験結果は、良性胆道狭窄症患者の人間の反応に一般化することはできません。 第二に、ブタの胆管の解剖学的構造はヒトの胆管の構造とは異なります。 ブタではヒトとは異なり、膵管と胆管が分離されています。 最後に、少数の実験動物を使用して有効性と実現可能性を評価しました。 それにもかかわらず、この研究には利点があります。 胆道に高周波温熱療法電極を使用する、再現性があり、安全で信頼性の高い方法による胆道狭窄の実験動物モデルの開発について紹介します。

結論として、ガイドワイヤー支援管内 RFA を用いた BBS の in vivo ブタ モデルの有効性と安全性は、前臨床実験動物研究を通じて確認されました。 将来的には、人体における胆管プラスチックステントの有効性と安全性を評価するために使用できる優れた方法を開発する必要があります。

動物実験には、生後 10 ～ 12 週齢で平均体重 50 kg のメスのマイクロブタ (マイクロブタ M タイプ、Medi Kinetics Co., Ltd.、京畿道平沢市) を合計 6 頭選択しました。 実験を開始する前に、動物を 1 週間順応させました。 これらの実験には健康な動物のみを使用しました。 いずれも温度23±2℃、相対湿度50±5%、換気頻度10～12回/時間、照明時間08:00～20:00に設定された動物飼育室で飼育された。 、照度は約400ルクス。 隔離期間および実験期間中、各豚は 1 つのケージに入れられました。 固形飼料（ピュリナ）を１日２回、始業前と午後４時に１回与えた。 実験は、処置前日の 24 時間の絶食後に実施されました。 この研究は、AAALAC International (国際実験動物管理評価認定協会) の認定機関であるサムスン生命科学研究所の動物実験倫理委員会の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました (IACUC 承認番号: 20160712001) in vivo 研究では、動物研究: In Vivo Experiments の報告ガイドライン (ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org)) に従いました。

合計 6 頭のメスのマイクロブタを 3 つのグループ (1 グループあたり 2 頭) にランダムに割り当て、1 か月間、3 か月間、および 5 か月間モニタリングしました。 電極胆管焼灼を用いた胆道狭窄モデルは、以前に公開された方法10に基づいて実行されました。 簡単に説明すると、24 時間絶食した後、獣医師がケタミン® 50 mg/ml 20 mg/kg、ゾラゼパム (Zoletil®; 6 mg/kg) およびキシラジン (Rompun®; 2 mg/kg) の筋肉内注射を使用してブタを鎮静させました。 ）。 その後気管挿管を行った。 気管挿管後、2%イソフルランを使用して麻酔を維持した。 心電図、心拍数、血圧、酸素飽和度、呼気終末 CO2 は獣医師によって監視されました。 処置による胆管炎を防ぐために、エンロフロキサシン (2.5 mg/kg) を処置前と処置 2 日後に筋肉内投与しました。 手術当日、痛みを抑えるためにケトプロフェン(2mg/kg)を筋肉内投与した。 内視鏡的逆行性胆管膵管造影 (ERCP) は、治療用内視鏡 TJF240 (Olympus America, Inc, Melville, NY, USA) を使用して実施されました。 まず、十二指腸乳頭を見つけて観察しました（補足図1A）。 ERCPは、X線透視下でガイドワイヤーを使用して胆管に選択的にカニューレを挿入できるワイヤーガイドカニューレ挿入法を使用して実行されました（補足図1B）。 その後、ハリケーンバルーンカテーテル（ボストンサイエンティフィック社製、直径１０ｍｍ）を用いてガイドワイヤーに沿ってファーター膨大部（ＡＯＶ）を拡張した。 次に、胆管内高周波アブレーション (RFA) 電極をガイド ワイヤーとともに胆道に挿入しました (補足図 1C、D)。 CBD に取り付けられた RFA 電極（ELRA 電極、7 ～ 10 W/33 mm タイプ、STARmed Co. Ltd、韓国京畿道高陽市）を 10 W、80 °C で 90 秒間の焼灼に使用しました19。 20、21。 CBD と RFA 電極間の接触面を最大化するために、吸引技術が使用されました21。

管内 RFA の 2 週間後、処置された実験動物の胆管狭窄を確認するために ERCP が実行されました。 白血球（WBC）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、アルカリホスファターゼ（ALP）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）およびC反応性タンパク質（CRP）を含む血液検査は、手術前と手術後に実施されました。手順と最終フォローアップで。 蛍光透視下で 0.035 インチのガイドワイヤ (Hydrophilic Tipped Guidewire、Boston Scientific Corp.、米国マサチューセッツ州ナティック) を使用して、2 つの市販の 10-F 胆管プラスチック ステント (外径 3.3 mm、内径 2.0 mm のポリウレタン チューブ、ポリエチレン チューブ)外径3.3mm、内径2.0mm）を胆道内に留置した（図7）。 プラスチックステントの近位端は、さまざまな枝の肝内胆管に位置するように取り付けられました（図7C）。

胆道狭窄およびプラスチックステント挿入のブタモデルにおける蛍光透視検査。 (A) 胆道狭窄のブタモデル (矢印) は、胆管造影画像によって確認されました。 上流の拡張を伴う総胆管の狭窄。 (B) プラスチック ステントはブタ胆管に正常に挿入されました。 (C) プラスチック ステントをブタの拡張した胆管に挿入しました。 プラスチックステントの近位端を肝内胆管の別の枝に配置しました（矢印）。

プラスチック ステントを挿入してから 1 か月後、3 か月後、および 5 か月後に、各時点で 2 頭のブタにケタミン (Ketmine®; 50 mg/ml 20 mg/kg)、ゾラゼパム (Zoletil®; 6 mg/kg) を筋肉注射しました。 、およびキシラジン (Rompun®; 2 mg/kg) が鎮静処置の当日に獣医師によって投与されました。 鎮静後、気管挿管を行った。 2%イソフルランを使用して麻酔を維持した。 心電図、心拍数、血圧、酸素飽和度、呼気終末 CO2 は獣医師によって監視されました。 すべてのブタの開腹手術は、1 人の非常に熟練した獣医師によって行われました。 正中切開を行い、十二指腸を切除しました。

胆管プラスチックステントを挿入してから 1 か月後、3 か月後、および 5 か月後にブタを安楽死させました。 次いで、病理組織学的検査が行われた。 実験動物から肝臓、胆道、胆嚢、十二指腸を摘出した後、大量のKCl（塩化カリウム）を注射して安楽死を誘導しました。 摘出した肝臓から、胆道、胆嚢、十二指腸、およびAoVを、左右の肝内胆管に位置するプラスチックステントの近位端まで切除した。 解剖後、縦方向に切開を行い、近位肝内胆管と遠位胆管狭窄を確認した。 各種プラスチックステントを挿入した肝内胆管から胆管組織を切開し、切片にし、H&E染色およびマッソントリクローム染色を行った。 以前の研究の組織学的スコアリング方法を強化するために、組織病理学的検査が行われました。 スコアリングは、H&E 染色組織切片を使用して盲検法で実行されました。 すべての切片は炎症の程度に従って分類されました (1) (1、最小、2、粘膜に限定、3、好中球浸潤を伴い筋肉にまで拡大)。 好中球浸潤の重症度は、なしを 0、軽度を 1、中等度を 2、重度を 3 としてスコア付けされました (2)。 粘膜潰瘍形成（3）の存在は、なしの場合は 0、局所的な場合は 2、びまん性の場合は 4 としてスコア付けされました（補足表 1）13、14、15。 補足表1に示す組織学的スコアリングシステムに基づいて、組織学的スコアはサムスン生命科学研究所の動物実験室の獣医師病理学者によって計算されました。

すべての実験は、組織病理学スコアを比較するために 3 回以上実行または測定されました。 すべての統計分析には、IBM SPSS バージョン 24.0 (IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用しました。

この研究のデータセットは入手可能です。 生のデータセットによって生成または分析されたすべての結果は、この公開記事および補足情報ファイルに含まれています。 さらに、研究中に生成された生のデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から研究目的で利用できます。

良性胆道狭窄症

高周波アブレーション

内視鏡的逆行性胆管膵管造影

白血球

アスパラギン酸トランスアミナーゼ

アラニントランスアミナーゼ

アルカリホスファターゼ

ガンマグルタミルトランスフェラーゼ

C反応性タンパク質

ヘマトキシリン・エオシン

マッソントリクローム

サイトケラチン 19

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リファレンスをダウンロードする

動物モデルの開発における BCM の献身に感謝します。 この研究は成均館大学研究基金によって部分的に支援されました。

韓国、翰林大学医科大学江南聖心病院内科

パク・ジェグン

成均館大学医学部サムスン医療センター内科消化器科、81 Irwon-ro、Gangnam-gu、Seoul、06351、韓国

ヤン・ジュイル、パク・ジュギョン、リー・グァンヒョク、リー・ジョンギュン、リー・ギュテク

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概念化、執筆 - 原案: JKP (Jae Keun Park)、方法論: KTL、形式分析: JIY、JKP (Joo Kyung Park)、調査とリソース: KHL、JKL、KTL、監督: KTL 最終原稿の承認: すべての著者。

イ・キュテク氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Park, JK, Yang, JI., Park, JK 他良性胆管狭窄に対するガイドワイヤー支援管内高周波アブレーションを用いた生体内ブタモデルの実現可能性。 Sci Rep 13、7185 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33867-9

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受信日: 2022 年 10 月 4 日

受理日: 2023 年 4 月 20 日

公開日: 2023 年 5 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33867-9

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